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延胡索乙素（tetrahydropalmatine，THP）是一种生物碱，又称四氢巴马汀，主要从罂粟科紫堇属植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥块茎中提取得到[1-2]，在我国有近千年的入药历史。研究显示，THP具有镇静、镇痛、抗心肌缺血、抗肿瘤、抗血栓、抑制胃酸分泌、抗心律失常、心肌缺血/坏死保护等药理活性[2-4]，研究开发价值较高。但THP水溶性较差[5-6]，溶出度低，体内易被代谢[7]，口服吸收生物利用度仅为6.59%[8]，势必影响THP药效发挥及其临床应用。THP新制剂研究有自微 乳[6]、纳米结构脂质载体[9]、脂质体[10]等制剂新技术的报道。
磷脂复合物（phospholipids complex，PC）是难溶性药物与磷脂在非质子溶剂中通过某种作用力（如氢键、范德华力等）结合在一起而形成的一种复合物。该复合物继承了磷脂的亲水亲油特点，使药物的水溶性和脂溶性均可达到提高[11-15]，为促进吸收奠定基础。但磷脂复合物是一种黏性物质，体外溶出较慢，影响生物利用度提升幅度[16-18]。
固体分散体（solid dispersion，SD）和油制剂（oil preparation，OP）在常规制剂中制备工艺相对简单可靠，故本研究将延胡索乙素磷脂复合物（THP-PC）进一步制备成延胡索乙素磷脂复合物固体分散体（THP-PC- SD）[19-20]和延胡索乙素磷脂复合物油制剂（THP- PC-OP）。纳米混悬剂（nanosuspensions，NPs）在纳米制剂中载药量较高，工艺相对简单，所以本研究进一步将THP-PC制备成延胡索乙素磷脂复合物纳米混悬剂（THP-PC-NPs）[21-22]，并比较其体外溶出情况及体内口服药动学行为，为THP新制剂研发提供新策略。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent 1100型高效液相仪器，配置DAD检测器，温控进样盘，美国安捷伦公司；BP-210D型电子分析天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；D8型X射线粉末衍射仪，瑞士布鲁克公司；R2000型旋转蒸发仪，艾卡仪器设备公司；DZF-6020型台式真空干燥箱，郑州生化仪器有限公司；MS-1型磁力搅拌器，上海尚普仪器公司；GJB300型均质机，常州均质机械设备公司；Nano ZS90型纳米粒度仪，英国Malvern公司；RC-6D型溶出仪，天津创兴电子设备制造公司；HX-10-50D型冻干机，上海沪析冷冻干燥机设备公司；SZ-24氮气吹扫仪，上海舜制仪器公司。
1.2 材料
THP原料药，批号20180915，质量分数97.6%，西安瑞盈生物科技有限公司；THP对照品，批号110726-201812，质量分数99.8%，中国食品药品检定研究院；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30），批号201748T234，德国BASF公司；白屈菜红碱对照品，批号MUST-18252556，质量分数98.7%，成都曼斯特生物科技有限公司；大豆磷脂，型号PC98T，批号20191125，上海辅必成生物科技公司；四氢呋喃，色谱纯，批号59162526，Merck公司。
SD大鼠，清洁级，购自河南省动物实验中心，许可证编号：SCXK-2016-0001，实验室饲养至体质量为（220±20）g，进行药动学实验前禁食12 h，自由饮水。所有动物实验遵循河南省胸科医院有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。
2 方法与结果
2.1 HPLC法测定THP含量
2.1.1 对照品溶液的制备
称取THP对照品20 mg置于50 mL量瓶中，加入甲醇超声溶解并定容，即得THP对照品储备液（400 ?g/mL）。
2.1.2 供试品溶液的制备
取THP、THP-PC、THP- PC-SD、THP-PC-OP及THP-PC-NPs粉末适量（THP含有量均约为5 mg），置于100 mL量瓶中，加入50 mL甲醇超声溶解，放置至室温后甲醇定容，过0.45 μm微孔滤膜，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，流动相定容即得供试品溶液。
2.1.3 色谱条件
色谱柱为Waters-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；柱温为30℃；流动相为甲醇-0.3%醋酸水溶液（45∶55）；检测波长为281 nm；体积流量为1.0 mL/min；进样量10 ?L。取磷脂、PVP K30等辅料制备空白辅料样品，另取THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP及THP-PC-NPs进样，色谱图见图1，制剂中辅料不干扰THP含量测定，理论塔板数不低于6500。
2.1.4 线性关系考察
取THP对照品适量，采用流动相配制成20、10、1、0.5、0.1、0.05 ?g/mL的THP对照品溶液，分别进样。以THP质量浓度（X）与峰面积（Y）作线性回归得方程Y＝24.155 2 X－0.746 9，r＝0.999 7，结果表明THP在0.05～20 ?g/mL线性关系良好。
2.1.5 精密度考察
取各样品的供试品溶液，分别连续进样6次，计算THP峰面积的RSD。结果显示，THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP、THP-PC- NPs中的THP峰面积的RSD分别为0.46%、0.92%、0.73%、0.58%，所以精密度良好。
2.1.6 稳定性考察
取各样品的供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、18、24 h进样，HPLC测定。结果显示，THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP、THP-PC-NPs中的THP峰面积的RSD分别为1.43%、0.90%、1.13%、1.29%，结果表明各供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.7 重复性考察
取各个样品，分别平行制备6份供试品溶液，HPLC测定。结果显示，THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP、THP-PC-NPs中的THP峰面积的RSD分别为1.15%、1.39%、1.64%、1.87%，结果表明该方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率考察
取各个样品适量（THP含有量均约为2.5 mg），分别置于9个100 mL量瓶中，分为低、中、高3组，加入样品中THP含量50%、100%、150%的THP对照品溶液，加入50 mL甲醇超声溶解，过0.45 μm微孔滤膜，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，流动相定容。THP-PC、THP-PC- SD、THP-PC-OP及THP-PC-NPs同法操作，分别进样测定THP含量并计算加样回收率。结果显示，THP- PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP、THP-PC-NPs的平均回收率在分别为99.04%、99.97%、100.89%、101.53%，RSD分别为1.74%、0.85%、1.18%、1.60%，结果表明本实验回收率较高。
2.2 复合率的测定
取70 mg的THP和适量磷脂置于三角烧瓶中，加入四氢呋喃40 mL的混悬液，于一定温度的水浴中磁力搅拌一定时间至澄清。45 ℃减压旋蒸10 min除去有机溶剂，即得THP-PC，该复合物为褐黄色黏稠状物质。THP不溶于石油醚，但THP-PC在石油醚中易溶。称取THP（X0）制备THP-PC，加入石油醚超声20 s溶解，过0.22 μm的微孔滤膜除去游离的THP，减压旋蒸除去石油醚，加入甲醇超声20 s溶解，进样测定参加复合的THP的量（X1）。计算THP与磷脂的复合率。
复合率＝X1/X0
2.3 Box-Behnken响应面法优化THP-PC处方工艺
2.3.1 试验设计及结果
采用THP与磷脂的复合率（Y）作为THP-PC的优化指标。前期单因素考察结果显示，当固定THP用量为70 mg时，磷脂用量（X1）、制备温度（X2）和制备时间（X3）对THP-PC的复合率影响较大，采用Box-Behnken响应面法对磷脂用量范围为100～200 mg，制备温度为25～65 ℃，制备时间为3～6 h进行优化，各因素水平见表1。根据不同试验组合制备不同处方工艺下的THP-PC，并分别测定复合率，结果见表1。
2.3.2 二次多元回归模型的建立及显著性分析
对Box-Behnken响应面法的因变量（X1、X2、X3）和自变量（Y）的数据拟合，得包封率Y二次多元回归方程为Y＝98.18＋8.08 X1＋11.04 X2－1.19 X3＋2.13 X1X2－1.48 X1X3－0.35 X2X3－9.37 X12－16.39 X22－0.09 X32，模型P值＜0.000 1，决定系数R2＝0.999 4，校正系数Radj2＝0.998 7，失拟度F＝ 0.205 8＞0.05，说明测得的复合率与拟合值吻合度高，未知因素对模型干扰很小，因此建立的数学模型可信度较高，可用于THP-PC处方工艺研究。方程中X1、X2系数绝对值相对较大，影响程度明显高于X3。方差分析结果见表2，X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X12和X22等均具极显著差异（P＜0.01）。
2.3.3 效应面结果、预测及验证
三维曲面图见图2，当制备时间不变时，随着制备温度的延长或磷脂用量的增大，复合率均先增大后下降；固定制备温度不变时，随着磷脂用量的增加复合率先增加后略下降，其影响程度远大于制备时间对复合率的影响；固定磷脂用量不变时，随着制备温度的增加复合率先增加后下降，其影响程度同样远大于制备时间对复合率的影响。设置复合率最小值为55.9%，最大值为100%，得最佳处方工艺为磷脂用量X1＝160.09 mg，制备温度X2＝48.47 ℃，搅拌时间X3＝3.57 h，预测复合率为101.85%。为便于操作，THP-PC最佳处方调整为X1＝160 mg，X2＝48.5℃，X3＝3.5 h。按此处方工艺，平行制备3份THP-PC，测得复合率分别为99.52%、99.71%和99.38%，复合率基本接近100%。
2.4 HTP-PC晶型分析
X射线粉末衍射法（XRPD）对THP-PC进行晶型分析。速度为8°/min，扫描范围（2θ）为3°～45°，Cu-Kα靶。取THP原料药、磷脂、THP-PC及物理混合物（比例THP-PC，仅作简单混合）适量置于玻璃槽中，玻璃片压制平整，置于X射线粉末衍射仪进行扫描，见图3。THP在6.3°、7.4°、10.9°、11.5°、12.1°、16.9°、18.0°、18.7°、20.2°、20.9°、24.1°、25.3°、29.7°及42.7°等处出现众多特征晶型峰，是一种晶型物质。在物理混合物中仍见THP的特征晶型峰，强度有所下降，但各峰的位置未发生任何变化，说明简单混合未改变THP的存在状态。但在THP-PC的XRPD图谱中，未见THP的晶型峰，说明存在形式发生了改变，转变成无定型物质，证明了THP-PC制备成功。
2.5 表观油水分配系数（P）的测定
分别配制pH 1.0、pH 2.5、pH 3.6、pH 4.5、pH 5.8、pH 6.8、pH 7.4、pH 8.0的水相溶液，加入正辛醇进行饱和。分别取过量THP、物理混合物（比例同THP-PC）和THP-PC加入到饱和后的不同pH值的水溶液中，于37 ℃振荡器中震荡3 d，取上层混悬液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液进样测定浓度C1。精密量取1 mL置于玻璃离心管中，平行8份，分别加入经不同pH值的水溶液饱和过的正辛醇5 mL，于37 ℃振荡器中震荡3 d。取下层水相过0.45 μm微孔滤膜，测得浓度C2。计算P，P＝ (C1－C2)/C2，并计算lgP。结果见图4。THP在不同pH值中的lgP变化较大，在酸性条件下水溶性较大，但在碱性条件下脂溶性较强，水溶性或脂溶性过大均不利于药物透膜吸收[12]。制备成THP-PC后有效调节了THP的表观油水分配系数，利于药物胃肠道吸收。而物理混合物对THP油水分配系数有一定影响，但无显著性意义。
2.6 THP-PC-SD的制备及表征
磷脂复合物热稳定性不好，因此，不适合采用熔融法制备成固体分散体，故采用溶剂法将THP-PC制备成THP-PC-SD。按照质量比1∶6，分别取THP-PC和PVP K30，置于无水乙醇中，45 ℃条件下磁力搅拌3 h至溶液澄清，45 ℃下减压旋蒸除去有机溶剂，即得THP-PC-SD粉末。
2.6.1 晶型分析
取适量THP、PVP K30、物理混合物（THP、磷脂和PVP K30比例同THP-PC-SD，仅作简单混合）和THP-PC-SD，按照“2.4”项下条件进行XRPD扫描，结果见图5，在物理混合物中仍可见THP原料药在10.9°、11.5°、12.1°、16.9°、
18.0°、20.2°、20.9°、24.1°、25.3°、29.7°及42.7°等处衍射峰，虽其强度下降，但各峰的位置并未发生变化，可能是由于处方中PVP K30用量较大，对衍射峰起到了掩蔽作用所致[15]。但在THP-PC-SD中THP的衍射峰全部消失，说明将THP-PC制备成THP-PC-SD后，THP仍是以无定形状态存在，同时也证明THP-PC-SD制备成功。
2.6.2 SEM分析
THP、物理混合物（THP、磷脂和PVP K30比例同THP-PC-SD，仅作简单混合）和THP-PC-SD适量，加入无水乙醇进行分散，取2～3 d至导电胶上，烘干后喷金2 min，置于SEM下观察，结果见图6。THP原料药为柱状形态，在物理混合物中可观察到原料药附着在辅料上，存在状态并未发生改变。但在THP-PC-SD中原料药的柱状形态消失，说明其存在状态发生变化，与XRPD研究结果一致。
2.7 THP-PC-NPs及其冻干粉的制备及表征
2.7.1 THP-PC-NPs及其冻干粉的制备
高压均质法制备THP-PC-NPs。取80 mg的PVP K30溶解于100 mL蒸馏水中（温度为45 ℃），另取40 mg的THP-PC超声分散于3 mL无水乙醇，水相与有机相合并后减压旋转蒸发10 min（温度为45 ℃）。混悬液于均质压力为40 MPa条件下循环均质5次，于80 MPa条件下循环均质8次，继续于100 MPa条件下循环均质8次，即得THP-PC-NPs混悬液。加入5%甘露醇，混匀，分成若干份，于?40 ℃超低温冰箱预冻1 d，迅速置于冷冻干燥机中进行冻干，即得THP-PC-NPs冻干粉。
2.7.2 粒径和ζ电位的测定
取适量THP-PC-NPs混悬液，蒸馏水稀释50倍，置于粒度仪中测得其ζ电位为（?31.26±1.93）mV，见图7；平均粒径为（184.57±10.41）nm，见图8。取适量THP-PC-NPs冻干粉蒸馏水复溶，测得平均粒径增长至（242.90±15.63）nm，ζ电位为（?28.05±1.69）mV。
2.7.3 SEM观察
取THP-PC-NPs混悬液100 μL，加入蒸馏水3 mL混匀，取2～3 d滴加至导电胶上，自然晾干并喷金2 min，置于SEM下观察其微观形态，结果见图9，THP-PC-NPs呈类球形。
2.8 THP-PC-OP的制备
中链三酰甘油具有良好的安全性和可耐受性，广泛应用于食品及医药领域，且磷脂复合物在中链三酰甘油溶解度良好，因此，本研究采用中链三酰甘油制备THP-PC-OP。过程为取100 mg的THP- PC，超声溶于10 mL中链三酰甘油，即得THP-PC油制剂。
2.9 溶出度测定方法
取THP、THP-PC、THP-PC-SD和THP-PC-NPs冻干粉适量，使THP含量均为30 mg，采用蒸馏水制备混悬液，置于透析袋中，各样品均平行制备6份。溶出介质为900 mL蒸馏水，温度和转速分别为37 ℃和100 r/min，于0、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、18、24 h取样3 mL，立即补进蒸馏水3 mL。各样品经0.22 μm微孔滤膜滤过，进HPLC测定THP质量浓度，计算各时间点累积溶出率，结果见图10。THP原料药24 h累积释放率为49.18%，THP-PC在各个时间点累积释放率均高于THP原料药，24 h累积释放率为69.47%，有一定的促溶出作用。将THP-PC制备成THP-PC-SD后溶出速率明显增大，8 h的累积溶出率达到96.02%。而THP-PC-NPs在 4 h累积溶出率达到95.67%，基本释放完毕。THP-PC-OP是一种溶液制剂，故不再考察体外溶出情况。
2.10 口服药动学比较
2.10.1 试验方案
取THP、THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-NPs粉末适量，加入适量0.5% CMC-Na溶液配制灌胃液，THP-PC-OP可直接灌胃给药。取SD大鼠30只，随机均分为5组，禁食12 h但可自由饮水，按大鼠体质量进行ig给药（30 mg/kg）。分别在0、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12 h眼眶后静脉丛取血约0.3 mL，毛细玻璃管引流至肝素化的离心管中，立即于3000 r/min离心3min，分取血浆密封，?15 ℃冰箱中冷冻保存。
2.10.2 血浆样品处理过程[23]
取白屈菜红碱适量，采用甲醇配制成600 ng/mL，作为内标溶液。吸取血浆样品100 μL，加入内标溶液50 μL和1 mL乙腈（含体积分数为0.05%甲酸），密封，涡旋2 min，于5000 r/min离心8 min，取有机相，40 ℃氮气吹干得残渣，加入100 μL甲醇涡旋30 s复溶，于5000 r/min离心5 min，进样测定。
2.10.3 血浆对照品标准曲线
取2.0 μg/mL的THP对照品溶液，甲醇稀释配制成质量浓度分别为1000、500、250、100、20 ng/mL，分别取100 μL，加入白屈菜红碱内标溶液50 μL，40 ℃氮气流缓慢吹干得残渣，分别加入空白血浆100 μL，涡旋混匀，即得THP血浆对照品溶液。按照“2.10.2”项下操作，进样测定。以THP质量浓度（X）为横坐标，THP与白屈菜红碱峰面积比（Y）为纵坐标，得方程Y＝0.042 6 X－2.450 1，r＝0.992 6，所以线性范围为20～2 000 ng/mL。
2.10.4 方法学考察
取空白血浆、血浆对照品和血浆样品进样，结果见图11，血浆内源性杂质不干扰THP及内标测定，因此专属性较高。取20、500、2000 ng/mL的血浆对照品溶液，连续进样6次，分别计算得THP与内标峰面积比值的RSD分别为9.97%、6.31%、9.17%，因此日内精密度良好。分别连续测定6 d，每天测定1次，分别计算得THP与内标峰面积比值的RSD分别为10.88%、7.18%、9.96%，因此日间精密度良好。取THP原料药ig给药1 h的血浆样品，分别于0、3、6、12、18、24 h进样测定THP与内标峰面积比值，计算得比值的RSD为6.49%，说明血浆样品稳定性良好。取20、500、2000 ng/mL的血浆对照品，进HPLC测定两者峰面积，计算峰面积比值，带入血浆对照品标准曲线方程计算测得浓度，并与配制质率浓度比较，计算得平均回收率为94.06%（n＝9），RSD值为7.93%，可见准确度较高。因此建立的色谱方法及血浆处理过程可用于血浆样品中THP的含量测定。
2.10.5 药动学结果
分别测定THP、THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP和THP-PC-NPs在各个时间点的血药浓度，药-时曲线见图12。DAS 2.0软件包拟合各组样品药动学数据，主要药动学参数结果见表3。THP-PC的tmax与THP原料药相比无统计学意义，但t1/2、Cmax、AUC0～t和AUC0～∞等参数有显著性改变，相对生物利用度提高至1.70倍，在一定程度上促进了THP体内吸收。THP-PC-SD、THP-PC-NPs和THP-PC-OP的tmax、Cmax、AUC0～t和AUC0～∞与THP或THP-PC相比均有显著性或极显著性差异（P＜0.05、0.01），药动学行为发生了较大变化。与THP原料药相比，THP-PC-SD、THP-PC-NPs和THP-PC-OP相对生物利用度分别提高至4.11、4.86、4.22倍，其中THP-PC-NPs提升幅度相对最大。
3 讨论
前期分别考察了制备溶剂（醋酸乙酯、乙醇、丙酮、四氢呋喃等）、制备温度（20～70℃）、磷脂用量（100～300 mg）、制备时间（2～6 h）等对THP-PC复合率的影响，发现采用四氢呋喃作为制备溶剂时复合率最高，可能是由于四氢呋喃是一种非质子溶剂，对THP及磷脂有较高的溶解度，有利于THP-PC的形成。
据文献报道[12]，质子溶剂（如乙醇）会对药物与磷脂的亲电基团与供电基团之间的电子传递产生影响，因而会干扰磷脂复合物的形成，影响复合率。磷脂容易被氧化，制备温度过高或制备时间过长时均会影响磷脂的稳定性，进而也会影响复合率。药物与磷脂分子一般是按照物质的量比1∶1结合在一起，磷脂用量不足时，复合率较低，但磷脂用量过大时造成材料浪费，故需要对磷脂用量进行优化。因此，选择磷脂用量、制备温度和制备时间为主要影响因素，采用Box-Behnken响应面法优化了THP-PC处方工艺，复合率接近100%。计算结果显示，THP与磷脂的物质的量比为1∶1.04。XRPD研究显示，THP在THP-PC以无定型状态存在，利于提高体溶出度及生物利用度[24]。
THP-PC是一种黏性物质，给药不便，故本研究进一步将其制备成THP-PC-SD、THP-PC-OP及THP-PC-NPs冻干粉。体外溶出结果显示，THP-PC体外溶出较为缓慢，但THP-PC-SD和THP-PC-NPs极大促进了THP体外溶出，且给药便捷性大大提高。
口服后，THP-PC的生物利用度提高至1.70倍，可能是由于THP的溶出度得到一定程度提高、降低了胃肠道对药物代谢作用[25]、调节了油水分配系数、促进胃肠道吸收等[25-26]作用所致。但磷脂复合物黏性较大，促溶出作用有限，且部分磷脂复合物在水相环境中可能发生解离[15]，因而生物利用度提高幅度受限。制备成THP-PC-SD后生物利用度提高至4.11倍，可能是由于制备成THP-PC-SD后THP仍以无定型状态存在、THP-PC的亲水性及分散性得到极大改善、加快体外溶出速率、提高了累积溶出度等[27]。
THP-PC-NPs进一步把生物利用度提高至4.86倍，可能是由于THP-PC-NPs充分融合了PC和NPs制剂新技术的优势[22]，增强了THP的透膜吸收能力、增加了药物与胃肠道的接触面、延长了胃肠道滞留时间、发挥纳米制剂特殊吸收机制 等[18,21]，从而实现高效吸收。THP-PC-OP生物利用度提高至4.22倍，可能是由于磷脂复合物在水中容易发生解离，析出原形药物，失去促吸收作用，当以油制剂形式给药后使THP-PC与水相隔离，增加了THP-PC稳定性；THP-PC-OP口服后在胃肠道蠕动作用下可能会形成微乳、胶束等[28-30]，从而使生物利用度远高于THP-PC。因此，THP-PC-SD、THP-PC-NPs和THP-PC-OP均可进一步促进THP-PC口服吸收，本研究为THP制剂研发提供了有价值的参考资料。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：李君霞，曹亚蕊，王金涛，方晓东．延胡索乙素磷脂复合物及其固体分散体、油制剂、纳米混悬剂的制备及药动学研究 [J]. 中草药, 2022, 53(14): 4307-4316 .
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