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类柠檬苦素不仅能使昆虫拒食，还具有抗化、抗病毒、抗癌等医疗保健价值，SAUR为植物特有的早期生长素响应基因，在植物的生长发育、生长素信号响应以及响应逆境胁迫等方面都起着至关重要的作用。
我们以CcISAUR49的过量表达和干扰表达的转基因植株为实验材料，通过形态学观察、基因表达分析、生长素和类柠檬苦素含量变化的检测等方法，解析生长素响应基因CcISAUR49对柑橘生长及类柠檬苦素代谢的影响及其作用的分子机制。
通过qRT-PCR对野生型和转基因植株叶片中GcISAUR49的表达水平进行检测分析，结果如图 3-4，6 株过量表达植株叶片中 CcIS.AUR49 的表达水平显著高于野生型，分别是野生型的 2.47~73.29 倍，其中表达水平最高的为 OE6、最低的为 OE2。与过量表达植株相反，2 株干扰表达植株 Ri1 和 Ri2 叶片中 CcISAUR49基因的表达都受到抑制，分别为野生型的 47.22%和 22.66%。
SAUR 作为高等植物中最大的早期生长素应答基因家族，在植物的生长素信号响应、诱导细胞膨胀、顶端弯钩的形成以及响应逆境胁迫等过程中发挥重要作用，在本实验室前期的研究中，发现柑橘叶片中CcISAUR49基因的表达水平与类柠檬苦素含量呈现显著负相关。本研究从湖北早实枳中克隆得到CcISAUR49的CDS序列，分别构建 CcISAUR49 过量表达和干扰表达载体，经柑橘遗传转化获得了 CcISAUR49 过量表达和干扰表达的早实枳植株，为深入研究 CcISAUR49 影响柑橘类柠檬苦素的作用机制提供了遗传资源材料。
从每株野生型、过量表达和干扰表达植株的相同部位上采集4片完全展开的叶片，用去离子水浸湿的纸巾擦净后立即放入液氮中预冷，一起充分研成粉末，于-80“C冰箱中保存备用，用于基因表达水平分析、生长素含量检测和类柠檬苦素含量检测分析。
称取 0.10 g叶片粉末，加入 1.5 m 的PBS缓冲液(Cat.No.CB1010)，充分振荡混匀，4°C、8000 rpm 离心 20 min，吸取上清至新的2 ml离心管中备用。每个样本设置 3个技术重复，利用酶联免疫法分析植物材料中生长素(IAA)的含量，具体操作步骤参照植物生长素(IAA)ELISA 检测试剂盒说明书进行。在 Excel中以标准品的浓度为横坐标、对应吸光度为纵坐标绘制标准品线性回归曲线，按照曲线方程根据所测样品吸光度计算IAA的浓度。
野生型植株叶片下表皮气孔密度为 513.48个/mm?，选取的三株过量表达植株 OE1、OE4、OE6 的叶片下表皮气孔密度为 590.32~795.27 个/mm?，分别比野生型多 54.88%、23.31%、14.96%，0E1 与野生型间差异达显著水平;干扰表达植株 Ri1 和 Ri2 的叶片下表皮气孔密度为 451.17个/mm'和 450.78 个/mm?，分别比野生型低 12.13%和 12.21%。
与野生型相比，过量表达植株和干扰表达植株叶片下表皮气孔的长和宽均有不同程度的增长。比较气孔长度，三株过量表达植株的气孔长度比野生型增加 29.17%、31.79%、26.27%，差异显著，而干扰表达植株比野生型分别长 8.12%和 8.85%，差异不显著。比较气孔宽度，过量表达植株的气孔宽度比野生型增加 35.56%、18.31%、22.89%，干扰表达植株比野生型增加 32.04%和 33.80%，差异均达显著水平，野生型植株叶片的气孔长/宽比为2.48，小于过量表达植株的 2.80 和 2.51，显著大于干扰表达植株的 2.03 和2.01。
与野生型相比，过量表达植株叶片的上表皮厚度增加了 3.84%~37.26%、下表皮厚度增加了 13.93%~29.82%，干扰表达植株叶片的上表皮厚度增加 4.89%和1.76%、下表皮厚度减小 4.17%和 10.54%。野生型叶片的栅栏组织厚度为 680.87mm，相比于野生型，过量表达植株的栅栏组织厚度增加了 2.50%~21.83%，干扰表达植株的栅栏组织厚度增加了 20.96%和 11.51%。海绵组织厚度大小比较:过量表达植株>野生型>干扰表达植株。
相对于野生型，过量表达植株叶片的海绵组织厚度增加了 0.21%~29.07%，干扰表达植株叶片的海绵组织厚度减小了4.31%和 5.39%。野生型植株叶片的主叶脉直径为 5273.96 μm，过量表达植株为5746.06~6610.38 μm，干扰表达植株分别为 5388.89 μm 和 4484.16 μm，过量表达植株中 OE2、OE3、OE4、OE6 的叶片主叶脉直径显著大于野生型，干扰表达植株 Ri2 的叶片主叶脉直径显著小于野生型。
从每株野生型、过量表达和干扰表达植株的相同部位上采集4片完全展开的叶片，用去离子水浸湿的纸巾擦净后立即放入液氮中预冷，一起充分研成粉末，于-80“C冰箱中保存备用，用于基因表达水平分析、生长素含量检测和类柠檬苦素含量检测分析。
称取 0.10 g叶片粉末，加入1.5 m的PBS 缓冲液，充分振荡混匀，4℃℃、8000 rpm 离心 20 min，吸取上清至新的2 ml离心管中备用。每个样本设置 3个技术重复，利用酶联免疫法分析植物材料中生长素(IAA)的含量，具体操作步骤参照植物生长素(IAA)ELISA 检测试剂盒说明书进行，在 Excel 中以标准品的浓度为横坐标、对应吸光度为纵坐标绘制标准品线性回归曲线，按照曲线方程根据所测样品吸光度计算IAA 的浓度。
采用高效液相色谱法分析转基因植株和野生型植株叶片中类柠苦素的含量，类柠檬苦素的提取和检测参照余洪等，称取叶片粉末 0.05g提取类柠檬苦素，每个样品设置3次重复，将所得上清液用微孔过滤器过滤后使用液相色谱仪进行柠檬苦素和诺米林的含量测定。
柠檬苦素和诺米林的检测条件为:15进样量，以乙腈:水(38:62)为流动相，在 30“℃柱温、流速为1mL/min 下等度洗脱。以浓度均为 25 mg儿,的柠檬苦素和诺米林混合溶液为标样，用柠檬苦素和诺米林的总量代表类柠檬苦素的含量。
检测得到单位重量的新鲜叶片所含类柠檬苦素含量，同时称取新鲜叶片粉末于2 m 离心管中，放置于 70 ℃烘箱中烘干至恒重，再称量干重，计算叶片的干物质占比，将单位鲜重中类柠檬苦素含量换算为单位干重中类柠檬苦素含量。
采用高效液相色谱法分析转基因植株和野生型植株叶片中类柠苦素的含量，类柠檬苦素的提取和检测参照余洪等，称取叶片粉末 0.05g提取类柠檬苦素，每个样品设置3次重复，将所得上清液用微孔过滤器过滤后。
使用液相色谱仪进行柠檬苦素和诺米林的含量测定。柠檬苦素和诺米林的检测条件为:15 进样量，以乙腈:水(38:62)为流动相，在 30 °℃柱温、流速为1mL/min 下等度洗脱。以浓度均为 25 mg儿的柠檬苦素和诺米林混合溶液为标样，用柠檬苦素和诺米林的总量代表类柠檬苦素的含量。
检测得到单位重量的新鲜叶片所含类柠檬苦素含量，同时称取新鲜叶片粉末于2 m 离心管中，放置于 70 ℃烘箱中烘干至恒重，再称量干重，计算叶片的干物质占比，将单位鲜重中类柠檬苦素含量换算为单位干重中类柠檬苦素含量。
与野生型相比，过量表达植株叶片的上表皮厚度增加了 3.84%~37.26%、下表皮厚度增加了 13.93%~29.82%，干扰表达植株叶片的上表皮厚度增加 4.89%和1.76%、下表皮厚度减小 4.17%和 10.54%。野生型叶片的栅栏组织厚度为 680.87mm，相比于野生型，过量表达植株的栅栏组织厚度增加了 2.50%~21.83%，干扰表达植株的栅栏组织厚度增加了 20.96%和 11.51%。海绵组织厚度大小比较:过量表达植株>野生型>干扰表达植株，相对于野生型，过量表达植株叶片的海绵组织厚度增加了 0.21%-29.07%，干扰表达植株叶片的海绵组织厚度减小了4.31%和 5.39%。
为探究柑橘中生长素响应基因 CcISAUR49 影响植株的生长发育和类柠檬苦素代谢的作用机制，本章中以CcISAUR49的过量表达和干扰表达植株为实验材料，分析CcISAUR49基因引起植株生长发育、生长素和类柠檬苦素含量变化的规律，解析CcIS.AUR49基因对生长素和类柠苦素代谢的影响。
现有的研究表明，SAUR 基因可以通过调控细胞的大小或分化调控叶片的生长发育，通过对 CcISAUR49 转基因植株的形态观察发现，CcISAUR49对柑橘植株的生长发育有明显影响，过量表达CcISAUR49导致转基因植株叶片的气孔密度显著增大，干扰表达使植株叶片气孔密度减小，气孔作为植物与外界交换气体的通道，叶片气孔密度的差异会影响植物的光合作用和呼吸作用，从而影响植物的生长发育以及初生、次生代谢产物的合成或转运。
CcISAUR49过量表达植株和干扰表达植株在叶片厚度、主叶脉直径、叶片紧密度等性状上都与野生型存在明显差异。过量表达植株叶片主叶脉直径显著增大，而干扰表达植株叶片主叶脉直径减小。生长素在维管束中进行极性运输，并参与维管束的发育，叶片主叶脉的维管束组织结构的变化可能会影响生长素的极性运输，进一步影响维管束组织的发育。
相对于野生型，过量表达植株叶片厚度增加、叶组织结构和细胞间隙更疏松，而干扰表达植株的叶片厚度减小、叶组织结构和细胞间隙更紧密，表明CalSAUR49的表达能影响叶片各层组织的细胞体积及组织结构。
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